Erythropoetin

Erythropoetin (von altgriech. Vorlage:Polytonisch „rot“ und ποιεῖν „machen“, Synonyme: EPO, Erythropoietin, Epoetin, historisch auch: Hämatopoetin) ist ein Glykoprotein-Hormon, das als Wachstumsfaktor für die Bildung roter Blutkörperchen (Erythrozyten) während der Hämatopoese von Bedeutung ist. Als Therapeutikum wird biotechnologisch hergestelltes Erythropoetin vorwiegend bei der Behandlung der Blutarmut von Dialysepatienten, bei denen die Blutbildung infolge eines Nierenversagens gestört ist, eingesetzt. Daneben erwarb sich EPO durch zahlreiche Dopingskandale insbesondere im Radsport den zweifelhaften Ruf als „Radfahrerdroge“.

Datei:EPO Hämatopoese.jpg

Schnittstellen der Wirkung von EPO während der Hämatopoese (modifiziert nach G. Croston)
rote Pfeile: Erythropoese;
TGF = Transforming Growth Factor;
MIP = Macrophage Inflammatory Protein;
IL = Interleukin;
G-CSF = Granulocyte-Colony Stimulating Factor;
SCF = Stem Cell Factor;
IGF = Insulin-like Growth Factor;
FLT-3/FLK-2 = Rezeptor-Tyrosinkinase;
BFU-E = Erythroid Burst Forming Unit;
CFU-E = Erythroid Colony Forming Unit

Biosynthese und biologische Funktion

EPO gehört phylogenetisch zu einer Zytokinfamilie, die neben EPO auch Somatropin, Prolaktin, die Interleukine 2–7, sowie die sogenannten „Colony Stimulating Factors“ (G-CSF, M-CSF und GM-CSF) umfasst. Im Menschen wird EPO etwa zu 85-90 % in der Niere durch die Endothelzellen der um die Nierenkanälchen gelegenen Kapillaren und zu 10–15% auch durch die Hepatozyten der Leber gebildet. Zudem konnte eine Syntheseaktivität im Gehirn, in der Gebärmutter, im Hoden und in der Milz nachgewiesen werden.

Das EPO-Gen im Menschen befindet sich auf dem Chromosom 7 (Position 7q21-7q22). Die Synthese wird stimuliert durch eine verminderte Sauerstoffsättigung (Hypoxie) des Blutes. Dies führt zur Translokation der α-Untereinheit des „Hypoxie-induzierten Faktors“ (kurz HIF) vom Zytoplasma in den Zellkern EPO-exprimierender Zellen. Dort bindet HIF-α an die zugehörige β-Untereinheit (HIF-β), wodurch das fertige Heterodimer HIF-1 entsteht. Dieses wiederum bindet nachfolgend an das „cAMP response element-binding protein“ (kurz CREB) und einen weiteren Transkriptionsfaktor (p300). Der resultierende aus nunmehr drei Elementen bestehende Proteinkomplex leitet dann durch Bindung an die 3'-Flanke des EPO-Gens die Transkription in die zugehörige mRNA ein, deren Konstruktionscode anschließend ribosomal in das Proteingerüst des EPO-Moleküls translatiert wird.

Die Serumkonzentration des Hormons im gesunden Menschen liegt bei bis zu 19 mU/mL. Bei der Erythropoese bindet EPO im Knochenmark an den transmembranen Erythropoetin-Rezeptor der Vorläuferzellen des Typs BFU-E (Erythroid Burst Forming Unit), die zunächst zu den reiferen Vorläuferzellen des Typs CFU-E (Erythroid Colony Forming Unit) und schließlich zu Erythrozyten ausdifferenzieren.

Datei:JAK-STAT-Signaltransduktion nach EPO-Bindung.jpg

JAK-STAT-Signalweg nach Bindung von EPO an seinen Rezeptor (vereinfachte Darstellung)

Der Rezeptor (EpoR) gehört zur Familie der Zytokin-Rezeptoren, deren strukturelle Gemeinsamkeiten in zwei oder mehr immunglobulin-ähnlichen Domänen, vier gleich angeordneten Cystein-Resten und der extrazellulären Sequenz WSXWS (Trp-Ser-variable Aminosäure-Trp-Ser) bestehen. Die Bindung von EPO führt zu einer Homodimerisierung des Rezeptors, welche wiederum via Transphosphorylierung das rezeptorgekoppelte Enzym Janus Kinase 2 aktiviert. Dabei werden spezifische, intrazellulär rezeptorassoziierte Tyrosin-Reste phosporyliert und dienen hierdurch als Kopplungsstation für das Signaltransduktionsprotein STAT5, wodurch verschiedene Signaltransduktionskaskaden in Gang gesetzt werden. Insgesamt sind daran 94 Proteine beteiligt.

Pro Tag werden circa 200 Milliarden Erythrozyten gebildet. Zusätzlich zur eigentlichen Erythropoese wirkt EPO bei der Differenzierung der Vorläuferzellen als Apoptosehemmer und stimuliert in geringem Maße auch die Bildung von Megakaryozyten. Akute und chronische Insuffizienzen infolge degenerativer Erkrankungen der Niere führen zu verminderten EPO-Bildung und damit zur renalen Anämie.

Die Aufgabe von EPO im Organismus ist nicht allein auf die Bildung neuer Erythrozyten beschränkt. Immuncytochemische Hybridisierungsuntersuchungen haben gezeigt, dass EpoR in den unterschiedlichsten somatischen Zellen zu finden ist. Dazu gehören Neurone, Astrozyten, Mikroglia- und Herzmuskelzellen. EPO/EpoR-Interaktionen wurden in den verschiedensten nicht-blutbildenden Geweben in Zusammenhang mit Zellteilungsvorgängen, Chemotaxis, Angiogenese, Aktivierung intrazellulären Calciums und Apoptosehemmung nachgewiesen. Spezifische EPO-Bindungsstellen wurden in Nervenzellen nachgewiesen, insbesondere auch im Hippocampus, einer Hirnregion die besonders anfällig für eine durch Sauerstoffmangel verursachte Schädigung ist. In mehreren Tiermodellen des Hirninfarkts und des Sauerstoffmangels konnte ein schützender Effekt von EPO nachgewiesen werden.

Strukturelle Eigenschaften

Datei:EPO.jpg

Schematische Darstellung des EPO-Moleküls
Zuckerseitenketten (Glykosylierungen):
Asn24: N-glycosyliert, tri-antennär, di-sialyliert.
Asn38: N-glycosyliert, tetra-antennär, tetra-sialyliert.
Asn83: N-glycosyliert, tetra-antennär, tri-sialyliert.
Ser126: O-glycosyliert, mono-antennär, di-sialyliert.

Das EPO-Gen (5,4 kb, 5 Exons und 4 Introns) codiert ein Pro-EPO-Protein mit 193 Aminosäureresten. Bei der posttranslationalen Modifikation wird N-terminal ein Peptid mit 27 Aminosäureresten sowie der danach verbleibende C-terminale Asparaginrest durch eine intrazelluläre Carboxypeptidase abgespalten.

Chemisch ist humanes EPO ein saures, unverzweigtes Polypeptid aus 165 Aminosäure-Monomeren und einem Molekulargewicht von etwa 34 kDa. Die Tertiärstruktur besteht aus vier antiparallelen α-Helices inklusiver benachbarter Schleifen. Der Kohlenhydratanteil, der etwa 40 % der Molekülmasse beträgt, besteht aus einer O-glykosidisch (Ser 126) und drei N-glykosidisch (Asn 24, Asn 38 und Asn 83) gebundenen Zuckerseitenketten. Die Seitenketten ihrerseits setzen sich aus den Monosacchariden Mannose, Galaktose, Fucose, N-Acteylglucosamin, N-Acetylgalactosamin und N-Acetylneuraminsäure zusammen. Die N-glykosidisch gebunden Seitenketten besitzen mehrere Verzweigungen, die man auch als “Antennen” bezeichnet. Im Gegensatz zur konstanten Aminosäuresequenz des EPO-Moleküls sind die Zuckerstrukturen variabel. Man spricht in diesem Zusammenhang von der Mikroheterogenität des EPO-Moleküls, die sowohl im natürlichen (nativen) als auch im rekombinanten EPO (siehe unten) auftritt. Diese ist einerseits gekennzeichnet durch variable Abfolgen der Monosaccharide in den Zuckerseitenketten, anderseits durch die variable Anzahl der endständigen N-Actetylneuraminsäuren. Diese, auch unter dem Trivialnamen Sialinsäuren bekannt, sind entscheidend für die biologische Aktivität des Glykoproteins: Je höher der Sialylierungsgrad, desto höher sind die Aktivität und die Serumhalbwertszeit des Hormons. Bemerkenswert ist, dass hoch-sialylierte Isoformen in in vitro-Experimenten eine geringere Affinität zum EPO-Rezeptor zeigen. Dies erklärt wiederum, weshalb die asialylierten Isoformen, bei denen die endständigen Sialinsäuren entfernt sind, aufgrund der hohen Rezeptoraffinität unmittelbar in der Leber durch die parenchymalen Zellen (Hepatozyten), die den EPO-Rezeptor tragen, abgereichert werden und somit wirkungslos sind. Funktionale Isoformen werden dagegen nach und nach auch durch andere Körperzellen, die den EPO-Rezeptor tragen, abgebaut. Beim Abbau werden die EPO-Moleküle durch eine rezeptorvermittelte Endocytose in Lysosomen internalisiert und dort zerlegt.

Eine optionale Besonderheit des EPO-Moleküls ist die Sulfatierung N-glykosidischer Zuckerseitenketten. Die genaue Funktion der Sulfatierung, die sowohl im nativen als auch im rekombinanten Molekül (siehe unten) nachweisbar ist, ist bisher unbekannt.

EPO als Therapeutikum

Forschungsgeschichte

Die Forschungsgeschichte des Erythropoetins ist naturgemäß eng verknüpft mit dem Erkenntnisgewinn über Entstehung und Funktion des Blutes. Schon seit der Frühgeschichte ist die Bedeutung des Blutes für die Vitalität des Menschen bekannt. In vielen Kulturkreisen stand Blut im Zentrum ritueller Zeremonien. Häufig wurde das Blut eines starken Tieres oder eines getöteten Feindes verabreicht, um dessen Kraft und Mut auf den Empfänger zu übertragen. Selbst in der Bibel ist seine Bedeutung niedergeschrieben. Im 3. Buch Mose, Kapitel 17, Vers 11 heißt es: „Denn des Leibes Leben [Seele] ist im Blut (...)“.

Die erste erfolgreiche Bluttransfusion zur Behandlung einer Anämie nahmen Jean-Baptiste Denis, Leibarzt von Ludwig XIV. und der Chirurg Paul Emmerez 1667 in Paris vor. Sie führten dem Patienten, dessen Zustand sich nach der Tranfusion deutlich besserte, das Blut eines Lammes zu. Der englische Gynäkologe James Blundell führte 1825 die erste erfolgreiche homologe Transfusion am Menschen durch, bei der eine Patientin mit starken Blutungen das Blut ihres Ehemanns erhielt. Der genaue Hintergrund für die Wirkung ihrer Therapien blieb den behandelnden Ärzten jedoch verborgen. Erst zur Mitte des 19. Jahrhunderts lieferten Felix Hoppe-Seyler mit der Entdeckung des Hämoglobin und Ernst Neumann durch seine Arbeiten über das Knochenmark als Ort der Blutbildung erste fundamentale Erkenntnisse über die Entstehung und die Funktion des Blutes.

1863 erkannte der französische Arzt Denis Jourdanet indirekt den Zusammenhang zwischen erniedrigtem Sauerstoffpartialdruck und Erhöhung der Erythrozytenzahl, als er hämatokritische Untersuchungen an Personen durchführte, die sich längere Zeit in alpinen Höhenlagen aufgehalten hatten. Den direkten Zusammenhang stellte Friedrich Miescher 1893 her. Miescher beschrieb die Bildung der Erythrozyten als Ergebnis einer verminderten Sauerstoffversorgung des Knochenmarks. Im Jahr 1906 stellten der Franzose Paul Carnot und seine Mitarbeiterin Catherine Deflandere erstmals die Hypothese auf, dass ein humoraler Faktor die Blutbildung regele. Die beiden finnischen Nephrologen Eva Bonsdorff und Eeva Jalavisto gaben schließlich 1948 diesem Faktor den Namen Erythropoetin, kurz EPO.

Als eigentlicher „Entdecker“ gilt gemeinhin Allan Jacob Erslev, der 1953 die ersten fundierten wissenschaftlichen Publikationen veröffentlichte, in denen die Existenz von Erythropoetin zweifelsfrei bewiesen wurde. Zur Schlüsselfigur der weiteren EPO-Forschung wurde jedoch Eugene Goldwasser. 1954 bestätigten er und seine Arbeitsgruppe von der University of Chicago die Arbeiten Erslevs durch eigene Ergebnisse. Goldwasser und sein Mitarbeiter Leon Orris Jacobson konnten zunächst 1957 indirekt nachweisen, dass EPO in der Niere gebildet wird und 1977 dann erstmals humanes EPO aus dem Urin isolieren und aufreinigen. 1983 gelang Fue-Kuen Lin, einem Mitarbeiter bei Amgen, die Identifizierung des humanen EPO-Gens. 1984 berichtete Sylvia Lee-Huang vom New York University Medical Center erstmals von einer erfolgreichen Klonierung und Expression von rekombinantem EPO (rEPO) in Escherichia coli; die 1985 dann auch in Säugetierzellen gelang. Hierdurch wurde die großtechnische Produktion von rekombinantem EPO in geeigneten Mengen möglich.

Indikationen für die Therapie mit EPO

Von den gegenwärtig klinisch eingesetzten Wachstumsfaktoren besitzt EPO das größte Indikationsspektrum. Die klassische EPO-Therapie zielt darauf ab, die Bildung roter Blutkörperchen bei Patienten mit renaler Anämie, Tumoranämie und Anämien als Folge von Chemotherapien in Gang zu setzen oder zu unterstützen. Zudem gilt mittlerweile als gesichert, dass die Ansprechrate von hypoxischen Tumoren auf eine Radio- oder Chemotherapien durch die Zunahme der Tumoroxygenierung nach EPO-Applikation gesteigert werden kann.

Der molekulare Pathomechanismus einer Tumoranämie, der sich durch die Zugabe von EPO beheben lässt, beruht auf einer gestörten Eisenverwertung. Da diese Mechanismen auch bei chronischen Infektionen (etwa Morbus Crohn, Colitis ulcerosa) oder Sepsis nachweisbar sind, wird der Einsatz von EPO als therapieunterstützende Maßnahme seit einigen Jahren in klinischen Studien untersucht. Ferner werden EPO-Therapieformen beim Fatigue-Syndrom, beim Myelodysplastischen Syndrom, bei der Aplastischen Anämie, Osteomyelofibrose und HIV-Infektionen diskutiert. Seine zytoprotektiven Eigenschaften in Zellkultur- und Tiermodellen machen EPO zudem zu einem interessanten Kandidaten für die Behandlung von akuten neurologischen Erkrankungen wie beispielsweise dem Schlaganfall aber auch neurodegenerativen Erkrankungen. Laut einer 2006 veröffentlichten Pilotstudie kann EPO als Zusatztherapeutikum bei der Behandlung von schizophrenen Patienten möglicherweise eine leichte Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten bewirken. Die Autoren nehmen an, dass der beobachtete Effekt auf den protektiven Eigenschaften von EPO gegenüber neurodegenerativen Mechanismen beruhen könnte, die Ergebnisse sind jedoch bisher nicht durch weitere Forschungsgruppen bestätigt worden.

EPO-Präparate der ersten Generation

Im Gegensatz zum Insulin, das vor der Anwendung rekombinanter Insulinpräparate aus Bauchspeicheldrüsen von Schweinen stammte (siehe Organon), gab es eine solch „archaische“ Herkunft für EPO nicht. Erst durch die Isolierung des EPO-Gens sowie durch seine Klonierung und Expression in Säugerzellen war es mit Hilfe biotechnologischer Herstellungsverfahren möglich, das Hormon in Mengen zu produzieren, die für die Therapie ausreichten.

• Das US-amerikanische Biotechnologieunternehmen Amgen brachte 1989 das erste rekombinante EPO-Präparat (Epogen, Epoetin α) auf den Markt. In klinischen Studien der Phasen I und II konnte bereits ab 1986 an der University of Washington in Seattle nachgewiesen werden, dass die Therapie von Anämien mit rekombinantem EPO bei Krebs- und Nierenpatienten wesentlich nebenwirkungsärmer ist als Behandlungen mit Bluttransfusionen. Die patentrechtliche Lage erlaubt Amgen die Exklusivvermarktung von EPO-Präparaten in den USA bis ins Jahr 2015 (nach anderer Quelle läuft das Amgen-Patent 2011 aus.) Amgens Lizenznehmer in Japan ist der Brauereikonzern Kirin, dessen Pharmasparte die Epoetin α-Variante seit 2001 unter dem Handelsnahmen ESPO vertreibt. Im Oktober 2004 kündigte Kirin an, seine Kooperation mit dem japanischen Pharmakonzern Daiichi Sankyo im Vertrieb von ESPO auf dem asiatischen Markt im März 2005 zu beenden.
• Der US-amerikanische Pharmakonzern Johnson & Johnson entwickelte unter der Amgen-Lizenz ein Epoetin α, das unter den Handelsnamen Procrit innerhalb und Eprex außerhalb der USA erhältlich ist. In Europa wird das Präparat unter dem Handelsnamen Erypo durch Janssen Cilag (Ortho Biotech), einer Tochtergesellschaft von Johnson & Johnson, vertrieben. Weitere Handelsnamen für den Vertrieb in Italien sind Epoxitin und Globuren. In Spanien und Portugal ist Eprex auch unter dem Namen Epopen durch die Firma Esteve (Laboratorios Pensa) auf dem Markt. In Polen, Russland und der Ukraine wird das Präparat unter dem Namen Epoglobin durch Jelfa Pharmaceuticals vertrieben. Ebenfalls in Polen ist das Präparat Epox über den Arzneimitteldistributor Genexo auf dem Markt. In Bolivien ist ein durch die Firma Laboratories Bagó produziertes Präparat mit dem Namen Eritrogen erhältlich.
• Boehringer Mannheim brachte 1990 ein Epoetin-β-Präparat unter dem Namen NeoRecormon auf den Markt. 1997, als Boehringer Mannheim durch Hoffmann-La Roche aufgekauft wurde, erhielt der Pharmakonzern durch die EMEA die Zulassung für die europaweite Einführung. In Japan stellt die Firma Chugai, ein seit 2002 zu Hoffmann-La Roche gehöriges Pharmaunternehmen, ebenfalls seit 1990 ein Epoetin-β-Präparat unter dem Handelsnahmen Epogin her.
• Elanex Pharmaceuticals beziehungsweise seit 2001 Baxter International entwickelte mit dem Präparat Epomax (Epoetin ω) eine weitere EPO-Variante, die insbesondere in Ost-Europa (zum Beispiel Polen über die in Herne ansässige Firma Fumedica) für den Vertrieb zugelassen ist. In Indien vertreibt Hindustan Antibiotics Epomax als Baxters Lizenznehmer unter dem Handelsnahmen Hemax. Die ω-Variante wird in Argentinien bereits seit 1990 durch die Firma Bio Sidus ebenfalls unter dem Handelsnamen Hemax produziert.

Das rekombinante Expressionsvehikel für die Produktion der Varianten Epoetin α und β ist jeweils ein genetisch modifizierter Subclon einer Ovarialzelllinie des Chinesischen Streifenhamsters (Cricetulus griseus), eine so genannte CHO-Zelllinie (Chinese Hamster Ovary). Bei der Produktion der Variante Epoetin ω wird eine genetisch modifizierte und subclonierte Zelllinie aus der Niere eines Jungtieres des Syrischen Goldhamsters (Mesocricetus auratus auratus) verwendet (BHK-Zellen, Baby Hamster Kidney).

Alle rekombinanten EPO-Varianten unterscheiden sich vom nativen, endogenen Molekül in der Zusammensetzung der Zuckerstrukturen (Glykosylierungsmuster). Zudem gibt es auch Unterschiede zwischen den rekombinanten Varianten: Epoetin β weist gegenüber Epoetin α ein geringfügig höheres Molekulargewicht, ein breiteres Spektrum basischer Isoformen und damit einen niedrigeren Sialylierungsgrad auf. Der Anteil tetra-sialylierter Seitenketten ist bei Epoetin β jedoch mehr als doppelt so hoch wie bei Epoetin α. Nach Desialylierung zeigte Epoetin β im Vergleich zu Epoetin α im Mausmodell eine 20 % höhere pharmakologische Aktivität. Epoetin ω, bedingt durch die unterschiedliche Expressionszelllinie, unterscheidet sich strukturell von der α- und β-Variante durch die Abfolge der Zuckermonomere sowie durch die Anzahl der Verzweigungen in den Zuckerseitenketten (Antennärität).

EPO-Präparate der nächsten Generation

Der enorme Erfolg der ersten EPO-Präparate hat dazu geführt, dass (wie bei keinem anderen rekombinant hergestellten Wachstumsfaktor) zahlreiche Strategien entwickelt wurden, um die biologische Aktivität des EPO-Moleküls zu steigern, seine Anwendung zu erleichtern und seine Verträglichkeit zu verbessern. Ein Schwerpunkt lag dabei auf Strukturmodifikationen des Ausgangsmoleküls (Stichworte: Protein-Engineering, Proteindesign). Zudem konnten durch neue Erkenntnisse aus der medizinischen Grundlagenforschung neue Therapiefelder abgesteckt werden. Zur jüngsten Entwicklung in diesem Bereich gehören EPO-Analoga (im Englischen auch als „Mimetics“ bezeichnet), gentherapeutische Ansätze zur Steigerung der EPO-Verfügbarkeit im Organismus und Kombipräparate, die zum Beispiel zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen eingesetzt werden sollen.

Modifikationen des EPO-Moleküls

• 2001 generierte Amgen unter dem Handelsnamen Aranesp (Darbepoetin α) ein gentechnisch verändertes Erythropoetin. Dieses enthält durch den Austausch von fünf Aminosäuren weitere Zuckerseitenketten, wodurch sich der Anteil endständiger Sialinsäuren und hierdurch die Serumhalbwertszeit um etwa den Faktor drei erhöht. Unter den EPO-Präparaten der nächsten Generation ist es bisher als einziges therapeutisch zugelassen. Lizenznehmer für Amgens Darbepoetin α in Italien ist die Firma Dompe Biotec, die das Produkt unter dem Namen Nespo vertreibt. Darbepoetin α wird in CHO-Zellen produziert. 2004 startete Amgen eine Phase-I-Studie zur Anwendung eines hyperglykoslylierten Aranesp-Analogon mit der Kennung „AMG114“ bei der Behandlung von chemotherapie-induzierter Anämie. Im Juni 2006 stellte ein internationales Forscherteam auf dem 43sten Kongress der American Society of Clinical Oncology (ASCO) Ergebnisse einer Phase-III-Multicenterstudie vor, nach denen „AMG114“ bei einer Serumhalbwertszeit von 131 Stunden geeignet erscheint, um zeitgleich zur Chemotherapie unterschiedlicher Tumorformen (Brustkrebs, Darmkrebs, Non-Hodgkin-Lymphom) angewendet zu werden.
• Unter dem Aspekt einer längeren Wirkungsdauer und höheren Affinität zum EPO-Rezeptor wurde von Hoffmann-La Roche das EPO-Derivat CERA (Continuous Erythropoiesis Receptor Activator, interne Roche-Kennung: Ro 50-3821) entwickelt, bei dem das EPO-Molekül (das aus dem Präparat NeoRecormon bekannte Epoetin β) mit einem Methoxypolyethylenglycolpolymer verknüpft ist (so genannte PEGylierung). Durch die Polymerverknüpfung hat CERA ein Molekulargewicht von 66 kDa und ist damit fast doppelt so groß wie natives EPO. Die Serumhalbwertszeit nach intravenöser Gabe liegt gemäß Untersuchungen aus der klinischen Phase II bei rund 133 Stunden und ist damit mehr als fünfmal länger als bei Darbepoetin α. Gemäß neuesten Untersuchungen ist die Wirkung von CERA bestimmt durch eine „lockere und langsamere Bindung“ des Moleküls an den Erythropoetinrezeptor. Gegenwärtig befindet sich CERA auch in einer klinischen Studie (Phase III) bei der Therapie des Non-Hodgkin-Lymphom. Im April 2006 wurde bei der EMEA der Antrag eingereicht, das Präparat unter dem Handelsnamen Mircera in den Verkehr zu bringen. Mit einer Zulassung des Präparats zur Markteinführung wird ab 2007 gerechnet.
• An der Entwicklung pegylierter EPO-Präparate, die sich gegenwärtig in vorklinischen Versuchsstadien befinden, sind auch andere Unternehmen wie Bolder Biotechnology, Prolong Pharmaceuticals (mit EPEG), Neose (pegyliertes EPO aus Insektenzellen) und Lipoxen (Polysialinsäure statt Polyethylenglycol als Pegylierungspolymer) beteiligt.
• Die US-amerikanische Firma Syntonix arbeitet gegenwärtig auf der Grundlage ihrer patentierten Transceptor-Technologie an der Entwicklung eines Inhalationspräparates. Bei diesem ist das EPO-Molekül (Funktionseinheit) mit dem kristallinen Fragment (Fc) eines Antikörpers (Transporteinheit) zu einem Fusionsprotein verknüpft (so genannte Epo-Fc). Da das Lungenepithel eine hohe Dichte an Rezeptoren aufweist, die mit dem Fc-Fragment interagieren (so genannte FcRn), wird Epo-Fc, als Inhalationsspray zugeführt rasch in der Lunge aufgenommen und in den Blutkreislauf transportiert. Die Fc-Einheit des Fusionsproteins sorgt zudem dafür, dass die Serumhalbwertszeit gegenüber dem ’’nackten’’ EPO-Molekül deutlich verlängert ist. Dies beruht zum einen auf der erhöhten Molekülgröße (siehe CERA von Hoffmann-La Roche), die das Ausschleusen über die Niere verhindert. Zum anderen wird Epo-Fc nach Endocytose durch die Erythroblasten über den endosomalen Rezyklisierungsweg wieder in den Blutkreislauf abgegeben und steht so erneut zur Verfügung. Epo-Fc befindet sich in der klinischen Erprobungsphase (Klinik Phase I).
• Das US-amerikanische Biotechnologieunternehmen Warren Pharmaceuticals hat zusammen mit der dänischen Pharmafirma H. Lundbeck A/S ein EPO-Derivat entwickelt, dass bei der Therapie neurodegenerativer Erkrankungen helfen soll. Bei dem Präparat CEPO (Kurzform für carbamyliertes EPO) wurde an sämtliche Lysinmonomere des EPO-Moleküls ein Carbamylrest gekoppelt, wodurch sich seine Affinität zu spezifischen neuronalen Rezeptoren erhöht. Im Gegensatz zum nativen EPO-Molekül hat CEPO keine erythropoetischen Eigenschaften. Die Wirkung des Präparats beruht vielmehr auf antiapoptotischen Effekten, die das Absterben von myokardialem und neuronalem Gewebe unterbindet. Im Maus- und Rattenmodell konnten erste Erfolge bei der Behandlung von Schlaganfall und Enzephalitis erzielt werden. . Gleiches gilt für die Therapie des Herzinfarktes im Rattenmodell (Quelle: Fiordaliso F. et al. (2005) in Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 102:2046-2051.).

„Natürliche“ EPO-Varianten

• Ein Gemeinschaftsunternehmen der Firmen Sanofi-Aventis und dem US-amerikanischen Unternehmen Transkaryotic Therapies (seit 2005 vom britischen Pharmaproduzenten Shire Pharmaceuticals akquiriert) beabsichtigt, eine durch Genaktivierung aus transformierten, humanen Zellen (Linie HT-1080, isoliert aus einem acetabularem Fibrosarkom) erzeugtes EPO unter dem Markennamen DynEpo (Epoetin δ) zu vermarkten. Shire veröffentlichte erstmals im September 2006 Ergebnisse erfolgreicher Phase-III-Studien.
• Das französische Biotechunternehmen GenOdyssee hat durch Reihenuntersuchungen eine durch einen so genannten SNP gekennzeichnete natürliche EPO-Variante entdeckt, die in in vitro-Experimenten gegenüber nativem EPO eine um 30–50 % gesteigerte Aktivität aufweist. Die als „GO-EPO“ bezeichnete Variante zeigt allein durch den Austausch einer singulären Aminosäure in der Tertiärstruktur eine Konfigurationsänderung nahe der EPO-Rezeptor-Bindungstelle, die die Affinität des Moleküls zum Rezeptor deutlich erhöht.
• Der US-amerikanische Firma GlycoFi ist es gelungen, ein humanisiertes EPO in Hefen der Gattung Pichia (P. pastoris) zu generieren. Durch Einführung genetischer Knock-out-Elemente sowie humanspezifischer Gensequenzen in die Hefezellen konnten bei der postranslationalen Modifikation hefespezifische Glykosylierungen unterbunden und im Gegenzug humanspezifische Glykosylierungsschritte eingeführt werden. Im Mai 2006 wurde GlycoFi durch den US-Pharmakonzern Merck & Co. übernommen.

EPO-Mimetics

• Die in San Francisco ansässige biopharmazeutische Firma Gryphon Therapeutics (vormals Gryphon Sciences) hat das erste Synthetische Eryhtropoese-Protein (SEP) entwickelt. SEP ist ein vollsynthetisches Makromolekül, bestehend aus einem Polypeptidrückgrat mit 166 Aminosäuremonomeren, das eine hohe Sequenzhomologie zu dem nativen EPO-Molekül aufweist. Dieses Polypeptid ist in den Positionen Lys 24 und Lys 126 chemische verknüpft mit einem negativ geladenen anorganischen Polymer definierter Länge. Die Aktivität von SEP in vitro ist mit der von EPO vergleichbar. Dagegen ist die Serumhalbwertszeit etwa 2,5mal länger. Bereits 2002 erwarb Hoffmann-La Roche die Lizenz für die Anwendung des Proteins in den klassischen EPO-Therapiefeldern.
• Die US-amerikanische Firma Affymax entwickelt gegenwärtig in der klinischen Phase II ein Präparat unter dem Namen Hematide™. Dabei handelt es sich um ein kurzkettiges, zyklisches Polypeptid mit einer Disulfidbrücke, dessen Wirkungsweise der des nativen EPO entspricht (EPO-Analogon), dessen Aminosäuresequenz aber keine Homologie zum nativen EPO-Molekül aufweist. Seine Wirksamkeit im Tiermodell hat das Präparat bereits unter Beweis gestellt. Laut der Studienergebnisse geht Affymax von einem Behandlungsregime aus, das bei der Behandlung von Anämien lediglich alle drei bis vier Wochen eine Gabe des Präparats erforderlich macht.
• Die kanadische Firma ProMetic Biosciences hat mit „PBI-1402“ ein niedermolekulares EPO-Analogon entwickelt, das in klinischen Studien der Phase I stimulierende und antiapoptotische Effekte auf die Bildung von Erythrozyten und Granulozyten gezeigt hat.
• Unter der Kennung „PT-401“ arbeitet das in Florida ansässige Unternehmen DNAPrint Genomics in gegenwärtig vorklinischen Studien an einem EPO-Dimer-Präparat, das eine deutlich höhere Affinität zum EPO-Rezeptor haben soll als das native EPO.
• Das deutsche Biopharma-Unternehmen AplaGen aus Baesweiler hat ein EPO-Mimetikum entwickelt, bei dem das Funktionspeptid an ein Makromolekül gekoppelt ist. Ähnlich wie bei PEGylierten Molekülen soll durch die Erhöhung der Molekülgröße die Ausscheidung über die Nieren verzögert werden. Das Präparat befindet sich gegenwärtig in klinischen Studien der Phase I und kann bisher sowohl intravenös als auch parenteral angewandt werden. Das Unternehmen arbeitet auch an anderen Darreichungsformen.

Gentherapie

• Einen gentherapeutischen Ansatz verfolgt das britische Unternehmen Oxford BioMedica mit seinem Präparat Repoxygen in der vorklinischen Phase. Das Mittel wird intramuskulär gegeben und enthält adenovirale Genshuttle, mit Hilfe derer das EPO-Gen in die Muskelzellen transferiert wird. Die Expression des EPO-Gens wird gesteuert über einen sauerstoffsensitiven Transkriptionsfaktor. Auf diese Weise wird nur dann EPO in den transfizierten Muskelzellen gebildet, wenn die Sauerstoffsättigung im Blut einen kritischen Wert unterschreitet. Im Rahmen des Verfahrens gegen den Leichtathletiktrainer Thomas Springstein wegen des Verdachts auf Gendoping im Januar 2006 teilte Firmengründer Alan Kingsman mit, dass Oxford BioMedica die Produktion des Wirkstoffs bis auf weiteres eingestellt habe.

Induktoren der EPO-Synthese

• Das US-amerikanische Unternehmen FibroGen arbeitet an der Entwicklung eines Medikaments mit der Bezeichnung „FG-2216“. Die Substanz inhibiert die Funktion des Enzyms Prolylhydroxylase, das für den Abbau des des so genannten „Hypoxie-induzierten Faktors“ (kurz: HIF, siehe Kapitel Biosynthese und biologische Funktion) verantwortlich ist. Durch die so erreichte HIF-Stabilisierung wird das EPO-Gen überexprimiert. Eine ensprechende Wirkungsweise hat auch das ebenfalls von FibroGen entwickelte Präparat „FG-4592“, das bei der Behandlung des so genannten ACD-Syndroms (engl. Anemia of Chronic Disease) angewendet werden soll. Der japanische Pharmakonzern Astellas erwarb im April 2006 die Rechte für den Vertrieb beider Präparate außerhalb der USA .

Chimäre EPO-Proteine und Kombinationstherapien

• 1999 patentierte der italienische Pharmakonzern Menarini die Produktion eines Fusionsproteins in CHO-Zellen, das sich aus EPO und dem „Granulozyten-Makrophagen koloniestimuliernder Faktor“ (kurz: GM-CSF) zusammensetzt (US-Patent 5,916,773). Das Fusionsprotein mit der Bezeichnung „MEN 11303“ erzielte in In-vitro-Untersuchungen eine im Vergleich zu äquimolaren Dosen der Einzelfaktoren signifikante Verbesserung bei der Expansion von erythroiden Progenitorzellen. Gegenwärtig wird die Möglichkeit des Präparats bei der Ex-vivo-Vermehrung menschlischer Stammzellen untersucht.
• Das kanadische Unternehmen Stem Cell Therapeutics hat mit NTx-265 ein Behandlungsverfahren entwickelt, bei dem durch kombinatorischer Gabe von hCG (Humanes Choriongonadotropin) und EPO im Tiermodell Erfolge bei der Behandlung von Schlaganfällen erzielt werden konnten.

Nachahmerpräparate (Biosimilars)

Mit dem Ablauf der Patente für einige Biopharmazeutika (darunter auch EPO) seit 2004 und mit Hilfe der von der EMEA erlassenen Richtlinien für ähnliche biologisch-medizinische Produkte im Allgemeinen und der Richtlinien für ähnliche biologisch-medizinische Produkte, die rekombinantes Erythropoetin enthalten im Speziellen stehen die Generikahersteller in den Startlöchern. In einigen Ländern außerhalb der Europäischen Union sowie in Asien, Afrika und Südamerika sind EPO-Generika (Biosimilars) bereits verfügbar. Vielfach wäre es sinnvoller, von EPO-Plagiaten zu sprechen, da entsprechende EPO-Präparate bereits seit vielen Jahren im Umlauf sind und bei deren Herstellung und Vertrieb auf Patente und Lizenzen nur wenig Rücksicht genommen wurde. In den USA hat Amgen aufgrund der patentrechtlichen Situation gegenwärtig ein exklusives Vertriebsrecht. Richtlinien zur Einführung von Nachahmerpräparaten, wie sie die EMEA erlassen hat, wurden zwar bereits 2003 von der FDA angekündigt, bisher jedoch nicht umgesetzt. Nach gegenwärtigem Stand können US-amerikanische Generikahersteller erst im Jahr 2009 auf entsprechende Regularien hoffen . Innerhalb der EU ist damit zu rechnen, dass die ersten EPO-Biosimilars im Verlauf des Jahres 2007 in Verkehr gebracht werden...

siehe auch: Biogenerikum

Asien

• Seit 2000 drängen zahlreiche indische Pharmaunternehmen mit eigenen Präparaten auf den heimischen Markt. In der Mehrzahl handelt es sich um EPO-Biosimilars zu Johnson & Johnsons Präparat Eprex, das in Indien seit 1995 vertrieben wird. Hierzu zählen die Firmen Emcure mit den Präparaten Vintor und Epofer, Wockhardt mit Wepox, Zydus Biogen mit Zyrop, Ranbaxy mit dem Präparat Ceriton, Shantha Biotechnics mit Shanpoietin sowie Intas Pharmaceuticals mit den Präparaten Epofit und Erykine und Claris Lifesciences mit Epotin. Das in Bangalore ansässige Biotechunternehmen Biocon plant die Fertigstellung der nach eigenen Angaben größten Produktionsanlage zur Herstellung rekombinanter Proteine (darunter auch EPO) bis Ende 2005. Die Anlage wurde im April 2006 in Betrieb genommen.
• Das in Vancouver ansässige kanadische Pharmaunternehmen Dragon Biotech produziert seit 2004 ein generisches EPO in einer Anlage in Nanjing (China) und vertreibt dieses in China, Indien, Ägypten, Brasilien, Peru, Ecuador, Trinidad & Tobago sowie in der Dominikanischen Republik und im Kosovo. Zudem kündigt das Unternehmen die Entwicklung eines neuen EPO-Produktes für den europäischen Markt an.
• Neben Dragon Biotech sind weitere Unternehmen mit EPO-Präparaten auf dem chinesischen Markt vertreten. Zu ihnen gehören die in Hongkong ansässigen Firmen Refinex Medical und Medichem, ferner die Unternehmen Supertrade International (Präparat: SEPO), Beijing Four Rings Biopharmaceuticals, Shandong Kexing Bioproducts (Präparat: EPOSINO), Kelun Biopharmaceuticals und Shenyang Sunshine Pharmaceuticals (kurz: SSP). Die Firma PlasmaSelect aus München beabsichtigt die Vermarktung des von SSP vertriebenen EPO-Präparats EPIAO in Europa , das in China einen Marktanteil von etwa 40 % besitzt. Das in Shijiazhuang ansässige Pharmaunternehmen North China Pharmaceutical Group Corporation (NCPC), Chinas größter Produzent von Antibiotika, vertreibt ein durch sein Joint Venture GeneTech Biotechnology produziertes EPO-Präparat unter dem Handelsnamen GerEpo.
• In Vietnam produziert das in Ho-Chi-Minh-Stadt ansässige Unternehmen Nanogenpharma ein EPO-α-Präparat unter dem Namen „Bioetin“.
• In Süd-Korea ist das EPO-Präparat Epokine (EPO α) vom biopharmazeutischen Unternehmen CJ Corp auf dem Markt. Epokine ist auch in anderen asiatischen Ländern (zum Beispiel Pakistan und Philippinen) und Südamerika (zum Beispiel Chile) durch lokale Distributoren erhältlich. Das Präparat Eporon wird durch CJ Corps heimischen Konkurrenten Dong-A Pharmaceutical vertrieben. Im südamerikanischen und pazifischen Raum ist Eporon durch die kolumbianische Firma Chalver Laboratorios unter dem Namen Eritina auf dem Markt. Ein drittes Unternehmen ist LG Lifescience mit Espogen, das auch durch die Tochtergesellschaft LG Lifescience India in Indien vertrieben wird. Seit 2000 besteht eine Kooperationsvereinbarung zwischen LG Lifescience und dem schweizer Biogenerikaentwickler Biopartners für eine geplante Einführung von Espogen und anderen Biopharmazeutika in der Europäischen Union.

USA, Mittel- und Südamerika

• In Brasilien hat das Pharmaunternehmen Cristália in Kooperation mit dem halbstaatlichen Forschungsinstitut Instituto Butantan ein rezeptfrei erhältliches generisches EPO entwickelt.
• Auf Kuba wurde unter Federführung des staatlichen Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología eine generische α-Variante in CHO-Zellen entwickelt, die vom Pharmaunternehmen Heber Biotec mit Sitz in Havanna unter dem Handelsnamen Heberitro für den heimischen Markt vertrieben wird. Heber Biotecs lokaler Mitanbieter ist das Unternehmen CIMAB S.A. mit dem Produkt EPOCIM.
• Das US-amerikanische biopharmazeutische Serviceunternehmen Protein Sciences hat ein Verfahren zur Produktion von eines EPO-Biosimilars in Insektenzellen entwickelt und bietet dieses Verfahren als Lizenzgeber an. Das in Insektenzellen, die mit Baculoviren transfiziert sind, generierte EPO hat laut Firmeninformation eine biologische Aktivität, die etwa dem Doppelten des EPO-Standardpräprats (Epogen) entspricht.
• Die AXXO GmbH, ein in Hamburg ansässiges Unternehmen, erwarb unlängst die mexikanische Firma Nedder Farmaceuticos, die als Tochtergesellschaft unter dem Namen Axxo Mexico firmierte und unter anderem ein rekombinantes EPO für den lateinamerikanischen Markt produziert. Die heimischen Konkurrenten sind die Pharmaunternehmen Probiomed mit BIOYETIN™ , Pisa mit EXETIN-A und Laboratorios Cryopharma mit EPOMAX.

Afrika und Nahost

• In Südafrika wird seit 1997 durch die Firma Bioclones aus Johannesburg ein EPO-Präparat unter dem Handelsnamen Repotin (EPO α) hergestellt.
• Mindestens vier Unternehmen in Ägypten stellen EPO-Präparate für den heimischen Markt her: EIPICO mit Epoform, Amoun Pharmaceuticals mit Erypoietin, Sedico mit Epoetin und T3A Pharma mit Pronivel. In Argentinien wird Pronivel durch das Pharmaunternehmen Laboratorio Elea vermarktet.
• In Israel findet sich mit InSight Biopharmaceuticals der bisher einzige Hersteller von generischem EPO als Bulk-Ware. Die Firma Prospec TechnoGene produziert zwar ebenfalls α- und β-Varianten von EPO in CHO-Zellen, dies allerdings nur für Laborzwecke.

Europa

• Im Juni 2005 erhielt das kroatische Pharmaunternehmen Pliva durch die zuständige lokale Zulassungsbehörde die Erlaubnis, eines EPO-Generikums (Epoetal) in Kroatien zu vermarkten. Eine Ausweitung der Vertriebsrechte für den gesamteuropäischen Markt wurde in Zusammenarbeit mit dem australischen Unternehmen Mayne Pharma angestrebt, gemäß Pressemitteilung vom 22. Februar 2006 allerdings eingestellt. Hintergrund für diese Entscheidung sind möglicherweise die bei einer Inspektion im Januar/Februar 2006 durch die FDA festgestellten massiven Verstöße gegen die Richtlinien der Good Manufacturing Practice in Plivas Produktionsstätte in Zagreb . Nachdem auch eine Übernahme durch den isländischen Generikahersteller Actavis gescheitert ist, bemüht sich seit Juni 2006 das US-amerikanische Pharmaunternehmen Barr Pharmaceuticals um Pliva.
• In der Ukraine produziert das Unternehmen Biopharma ein EPO-Präparat unter dem Produktnamen Epocrin (Епокрин) für den heimischen und den russischen Markt.
• In England kündigte der Generikahersteller GeneMedix bereits im Mai 2005 die Markteinführung eines EPO-Präparats mit dem Produktnamen Epostim an, der inzwischen angestrebte Termin ist allerdings erst das dritte Quartal 2007.
• Der Unternehmensvorstand von Stada Arzneimittel erklärte in einer Pressemitteilung vom 30. März 2006, dass man die Einreichung der Zulassungsunterlagen bei der EMEA für die Produktion und den Vertrieb eines EPO-Generikums im zweiten Quartal 2006 plane und mit der Markteinführung Ende 2006 beziehungsweise Anfang 2007 zu rechnen sein werde. In vergleichbaren Entwicklungsphasen befinden sich offenbar auch Stadas Mitbewerber in Deutschland, Ratiopharm und Hexal. Am 30. Juni 2006 ließ STADA verlauten, dass das Unternehmen die Zulassungsunterlagen bei der EMEA für die Produktion eines Erythropoetin zeta am selben Tag eingereicht habe. Kooperationspartner für die Produktion des Biosimilars für die klinische Studie ist das in Bielefeld ansässige Biotechunternehmen Bibitec. Das US-amerikanische Unternehmen Hospira erwarb im November 2006 die Vertriebsrechte für Erythropoetin zeta für die Vermarktung in der Europäischen Gemeinschaft sowie in Kanada/USA.
• Der britische Generikahersteller Therapeutic Proteins kündigte in einer Pressemitteilung vom 12. Mai 2006 an, Zulassungsunterlagen bei der EMEA für die Produktion und den Vertrieb eines EPO-Generikums unter dem Handelsnamen TheraPoietin sowie für zwei weitere Biosimilars einzureichen. Die Produktion aller drei Biosimilars soll in Zusammenarbeit mit dem britischen Auftragsproduzenten Angel Biotechnology erfolgen.

Der Fall „Eprex“

Ab 1998 kam es infolge einer Novelle der EMEA zu schweren Nebenwirkungen bei der Anwendung des EPO-Mittels Eprex/Erypo. Auf Veranlassung der EMEA mussten sämtliche humane Proteinbestandteile im Zuge möglicher Kontaminationsrisiken durch HIV beziehungsweise Erreger der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit aus der Formulierung von Arzneimitteln entfernt werden. Der Hersteller Ortho Biotech verwendete daraufhin anstelle von humanem Serumalbumin den Stabilisator Sorbitol 80 (auch als Polysorbat 80 bezeichnet). Die Zugabe von Sorbitol führte fatalerweise zur Bildung von Mizellen. Diese lösten bei mindestens 250 mit Erypo behandelten Patienten Immunreaktionen und eine Erythroblastopenie (engl. Pure Red Cell Aplasia = PRCA) aus. Eine von Johnson & Johnson Studie ergab, dass Sorbitol 80 organische Bestandteile aus den unbeschichteten Gummistopfen der Applikationsspritzen herausgelöst hatte, welche wiederum zur Präzipitation und Mizellbildung des Präparats geführt haben. Dieser Zwischenfall warf weltweit die Frage auf, inwieweit auch veränderte Aminosäuresequenzen, abgewandelte Glykostrukturen oder Verunreinigungen bei der Herstellung therapeutischer Proteine und derer Derivate (zum Beispiel Biosimilars) zu derartigen Nebenwirkungen führen können. Die brasilianische Zulassungsbehörde Agência Nacional de Vigilância Sanitária (kurz: ANVISA) verhängte noch im selben Jahr ein Importverbot zweier EPO-Präparate. Bei einer Studie der Universität Utrecht zu acht Präparaten, die außerhalb der EU und der USA vertrieben werden, wurden gravierende Mängel hinsichtlich Wirksamkeit, Reinheit und Formulierungskonsistenz festgestellt. Deshalb ist davon auszugehen, dass auf Hersteller von Biosimilars zukünftig schärfere Kontrollen im Rahmen klinischer Studien und strengere Regularien zur Markteinführung zukommen.

Darreichungsformen

Die übliche galenische Form der durch zuständige Behörden gegenwärtig zugelassenen EPO-Präparate ist die einer Injektionslösung mit unterschiedlicher Wirkstoffkonzentration (etwa 500 bis 30.000 IE). Neben EPO enthält die Lösung auf der Basis von Wasser für Injektionszwecke zusätzlich Hilfstoffe (etwa Harnstoff, Polysorbat 20, verschiedene Aminosäuren und Natriumsalze), die der Wirkstoffstabilität dienen. Die Injektionslösungen werden entweder subkutan oder intravenös appliziert. Je nach Applikation, Wirkstoffkonzentration, Indikation und Wirkungsdauer oder Serumhalbwertszeit des Präparats sind mehrere Injektionen pro Woche oder auch nur eine einmaligen Injektion pro Monat erforderlich.

Da EPO-Rezeptoren auf der Oberfläche verschiedenster Tumorzellen gebildet werden, besteht grundlegend die Möglichkeit, dass die Verabreichung von EPO-Präparaten das Wachstum von Malignomen jeglicher Art stimulieren kann. Zwei kontrollierte klinische Studien, in denen Patienten mit verschiedenen Krebsarten einschließlich Kopf-Hals-Tumoren sowie Brustkrebs mit rekombinantem EPO behandelt wurden, zeigten einen ungeklärten Anstieg der Mortalität. Gute Erfahrungen bestehen bei der Anämiebehandlung von Multiplem Myelom, Non-Hodgkin-Lymphom und chronisch lymphatischer Leukämie. Aufgrund der Nebenwirkungsweise ist bei hypertonischen Patienten besondere Vorsicht geboten. Missbrauch von Gesunden (etwa für Dopingzwecke) kann zu einem übermässigen Anstieg des Hämatokritwertes führen. Dies ist mit dem Risiko lebensbedrohlicher Komplikationen des Herz-Kreislauf-Systems (Thromboserisiko durch Hämokonzentration bei Polyglobulie) verbunden.

Datei:EPO sales.jpg

Weltweite Marktdaten der gängigsten EPO-Präparate

Marktdaten für EPO-Präparate

Als Therapeutikum rangiert EPO unter den zehn weltweit erfolgreichsten Medikamenten überhaupt, unter den Biopharmazeutika ist es der herausragende Blockbuster. Eprex/Procrit von Johnson & Johnson erzielte im Jahr 2004 3,6 Milliarden US-Dollar, Amgens Epogen 2,6 Milliarden Dollar und Roches NeoRecormon 1,7 Milliarden Dollar (Quelle: Chemical & Engineering News Nr. 83). Aranesp, das erste zugelassene EPO-Präparat der nächsten Generation, hat seit seiner Therapieeinführung eine durchschnittliche Zuwachsrate von rund 800 Millionen Dollar pro Jahr und wird die Umsatzzahlen der bisherigen Standardpräparate im Jahr 2007 voraussichtlich übertreffen. Bei den Nachfolgepräparaten Mircera und DynEpo wird mit anfänglichen Umsatzraten von 300 Millionen Dollar (DynEpo) oder 900 Millionen Dollar (Mircera) gerechnet. Der weltweite Bedarf an EPO zu Therapiezwecken ist bei weitem nicht gedeckt. Nach Schätzungen von Marktanalysten werden Hersteller von EPO-Präparaten im Jahr 2010, aufgrund zunehmender Indikationen und trotz der Einführung von Nachahmerpräparaten, insgesamt bis zu 17 Milliarden Dollar erwirtschaften (Quelle: Piribo – Online Buisiness Intelligence for the BioPharma Industry, Feb. 2005: Therapeutic Proteins, Strategic Report, Visiongain). Weltweit erhalten circa 350.000 Patienten rekombinantes EPO (Stand: 1999). Da sich die Umsatzzahlen der EPO-Präparate zwischen 1999 und 2005 mehr als verdreifacht haben, dürfte die Zahl der mit EPO behandelten Patienten entsprechend gestiegen sein.

EPO-Doping

Je mehr rote Blutkörperchen dem menschlichen Blutkreislauf zur Verfügung stehen, desto leistungsfähiger arbeitet der gesamte Organismus, weil entsprechend viel Sauerstoff den Zellen zur Verfügung steht. Aus diesem Grund wird EPO bereits etwa seit Ende der 1980er Jahre zum Zweck der Leistungssteigerung missbraucht. Vor allem Ausdauersportler profitieren von der Wirkung; durch den erhöhten Anteil an Erythrozyten im Blut steigt allerdings die Gefahr von Blutgerinnseln. EPO (und in der Folge auch alle weiteren Derivate wie zum Beispiel Darbepoetin) steht seit 1990 auf der Dopingliste der internationalen Anti-Doping-Organisation WADA, der Einsatz ist also im Wettkampfsport verboten.

Prominente EPO-Dopingfälle

• EPO wurde mit der gewichtigen Nebenrolle, die es bei der Tour de France 1998 unter anderem durch Funde bei der Festina-Mannschaft erlangte, Inbegriff der leistungssteigernden, aber nur schwer nachweisbaren Sportdroge. Die Funde und die Ermittlungen rund um die Festina-Mannschaft wurden auch unter dem Namen Festina-Affäre bekannt. In der Folge wurden die für Festina startenden Radprofis Richard Virenque, Laurent Brochard und Alex Zülle durch die UCI gesperrt.

• Im Jahr 2000 gestand der ehemalige Schweizer Radprofi Rolf Järmann, seit Beginn der 1990er Jahre systematisch mit EPO gedopt zu haben.

• Im Vorfeld der Deutschland-Tour 2000 wurde der Radprofi Holger Sievers des EPO-Dopings überführt, vom Bund Deutscher Radfahrer mit einer siebenmonatigen Sperre belegt und von seinem damaligen Team „Nürnberger“ fristlos entlassen.

• Im Vorfeld der Tour de France 2001 wurde der für das Euskaltel-Euskadi-Team startende Baske Txema Del Olmo des EPO-Dopings überführt. Der spanische Radsportverband sah jedoch von einer Sperre mit der Begründung ab, die neue Nachweismethode (siehe unten) sei fehlerhaft. Der halbstaatliche französische Anti-Dopingrat CPLD verhängte demgegenüber im Februar 2002 eine dreijährige Sperre gegen Del Olmo.

• Bei den Olympischen Winterspielen 2002 in Salt Lake City wurde der für Spanien startende Ski-Langläufer Johann Mühlegg der Einnahme von Darbepoetin überführt und der Gewinn dreier Goldmedaillen daraufhin annulliert. Bei derselben Olympiade wurden die beiden russischen Langläuferinnen Olga Danilowa und Larissa Lasutina des Dopings mit Darbepoetin überführt. Danilowa wurden ihre Goldmedaille im Verfolgungsrennen über 15 km und die Silbermedaille im Rennen über 10 km klassisch aberkannt. Lasutina musste ihre Goldmedaille beim Rennen über 30 km sowie ihre beiden Silbermedaillen im Verfolgungsrennen über 15 km und im Rennen über 10 km zurückgeben.

• Der Marokkaner Brahim Boulami wurde im August 2002 nach seinem Weltrekord im 3000 m Hindernislauf beim Golden League Meeting in Zürich der illegalen EPO-Einnahme überführt. Der Weltrekord wurde ihm aberkannt und er wurde für zwei Jahre von allen Leichtathletikwettbewerben ausgeschlossen.

• Beim Giro d'Italia 2003 wurde der litauische Radprofi Raimondas Rumšas der illegalen Einnahme von EPO überführt, vom UCI gesperrt und darauf von seinem Team Lampre suspendiert.

• Bei der Tour de France 2003 wurde der spanische Radprofi Javier Pascual Llorente (Kelme) nach der zwölften Etappe positiv auf EPO getestet und im November desselben Jahres vom internationalen Sportgerichtshof für 18 Monate gesperrt.

• Im Juni 2004 gestand der für das Team Equipe Cofidis startende britische Radprofi David Millar nach polizeilichen Verhören ein, beim Titelgewinn der Zeitfahr-WM in Hamilton (Kanada) mit EPO gedopt gewesen zu sein. Der Australier Michael Rogers wurde daraufhin nachträglich zum Weltmeister erklärt und Millar von Cofidis fristlos entlassen.

• Am 22. Juli 2004 wurde der Schweizer Profi-Radrennfahrer Oscar Camenzind bei einer Doping-Kontrolle positiv auf EPO getestet. Er verzichtete darauf auf eine Teilnahme an den Olympischen Sommerspielen 2004 in Athen, wurde von seinem Radsportteam Phonak Cycling Team am 9. August 2004 freigestellt und verkündete am darauffolgenden Tag in Luzern sein Karriereende.

• Der US-amerikanische 400-m-Weltmeister Jerome Young wurde im Rahmen des Golden-League-Meeting am 23. Juli 2004 in Paris der illegalen Einnahme von EPO überführt. Bereits im Juni 1999 war Young positiv auf das anabole Steroid Nandrolon getestet worden. Als Wiederholungstäter wurde er daraufhin am 3. November 2004 lebenslang gesperrt.

• Der belgische Mountainbiker Filip Meirhaeghe, Gewinner der Silbermedaille bei den Olympischen Sommerspielen 2000 in Sydney, wurde am 29. Juli 2004 beim Weltcup in Mont Sainte-Anne (Québec, Kanada) des EPO-Dopings überführt und für 15 Monate von allen Wettkämpfen ausgeschlossen.

• Im November 2004 wurde die Gewinnerin des Ironman Hawaii, Nina Kraft, postitiv auf EPO getestet. Nach ihrem Eingeständnis des Medikamentenmisbrauchs wurde die Athletin der Deutschen Triathlon Union für zwei Jahre gesperrt und die Schweizerin Natascha Badmann nachträglich zur Siegerin erklärt.

• Ebenfalls im November 2004 wurde der Teamarzt des italienischen Fußballmeisters Juventus Turin, Ricardo Agricola, vom Internationalen Sportgerichtshof (CAS) in Lausanne wegen Sportbetrugs und Verabreichung gesundheitsgefährdender Medikamente zu 22 Monaten Haft auf Bewährung verurteilt. Er hatte laut Gerichtsurteil zwischen 1994 und 1998 Spieler des Vereins unter anderem systematisch mit EPO behandelt. Agricola ist in Berufung gegangen. In besagtem Zeitraum wurde keiner der Spieler in Dopingkontrollen positiv getestet. Forderungen, Juventus die damals gewonnenen Titel abzuerkennen, hatte bereits der Präsident des Weltverbandes Fifa, Joseph Blatter, zurückgewiesen.

• Im Dezember 2004 wurden laut einem Bericht der französischen Zeitung L'Équipe vom 23. August 2005 in tiefgefrorenen Urinkonserven des siebenmaligen Tour-de-France-Siegers Lance Armstrong sowie sechs weiterer Radprofis aus dem Jahr 1999 Spuren von nicht körpereigenem EPO nachgewiesen. Jedoch bestreitet Armstrong, gedopt zu haben.

• Im Juni 2005 ergab eine Routinekontrolle der Fachkommission für Dopingbekämpfung FDB von Swiss Olympic ein EPO-Doping bei Brigitte McMahon, Siegerin im Triathlon bei den Olympischen Spielen von Sydney 2000. Sie trat daraufhin vom aktiven Leistungssport zurück.

• Im August 2005 gestand der italienische Radprofi Dario Frigo vom Team Fassa Bortolo ein, bei der vergangenen Tour de France mit EPO gedopt zu haben, nachdem er vor Beginn der elften Etappe der Tour von der französischen Polizei wegen Doping-Verdachts festgenommen worden war. Frigo wurde im Oktober 2005 in Zusammenhang mit der Dopingaffaire beim Giro d'Italia 2001 zu sechs Monaten Haft auf Bewährung und einer Geldstrafe von 12.000 Euro verurteilt.

• Im November 2005 wurde Vuelta-Rekordsieger Roberto Heras positiv auf EPO getestet. Der Gewinn seines letzten Titels bei der Spanienrundfahrt wurde ihm daraufhin aberkannt und stattdessen der Russe Denis Menchov zum Sieger erklärt. Heras bestreitet die wissentliche Einnahme von Dopingmitteln und kündigte im Februar 2006 die Einleitung eines Berufungsverfahrens gegen die gegen ihn erlassene zweijährige Sperre an. Sein Rennstall Liberty Seguros-Würth (seit Mai 2006 Team Astana) entließ ihn dennoch fristlos. Am 23. Mai 2006 wurde Teamchef Manolo Saiz zusammen mit dem Physiotherapeuten von Liberty Seguros-Würth, Eufemiano Fuentes, von der Guardia Civil festgenommen. Weitere Konsequenz der Durchsuchung war die Suspendierung von Jan Ullrich, Oscar Sevilla und Rudy Pevenage vom Team T-Mobile sowie der Ausschluss von 56 weiteren Radsportlern (darunter Ivan Basso vom Team CSC), die ebenfalls im Verdacht stehen, mit Fuentes zusammengearbeitet zu haben, von der Tour de France 2006. Dabei soll es sich auch um Blutdoping und den Missbrauch von EPO handeln.

• Im Rahmen einer Razzia, die italienische Justizbehörden veranlassten, wurden im Quartier der österreichischen Ski-Langläufer und Biathleten bei den Olympischen Winterspielen 2006 von Turin laut der österreichischen Nachrichtenagentur neben anderen verbotenen Hormonen auch Spuren von EPO gefunden. Jedoch konnte bei keinem der verdächtigten Athleten EPO-Doping nachgewiesen werden.

• Im Juni 2006 wurde die A-Probe von US-Sprintstar Marion Jones bei den amerikanischen Leichtathletik-Meisterschaften einer Meldung der Washington Post zufolge positiv auf EPO getestet. Das Ergebnis der Analyse der B-Probe, die vom gleichen Labor an der University of California in Los Angeles untersucht wurde, entlastet dagegen die Athletin.

• Am 21. September 2006 gab der Österreichische Radsportverband bekannt, dass drei österreichische U23 Radfahrer, die bei der Heim-WM hätten starten sollen, positiv auf EPO getestet wurden.

• Das belgische Radsportidol Johan Museeuw gab im Januar 2007 zu, während seiner aktiven Zeit auf verbotene Substanzen zur Leistungssteigerung, darunter auch EPO, zurückgegriffen zu haben. Bereits 2004 sperrte ihn der belgische Radsportverband auf Grundlage von Telefon- und SMS-Abhörprotokollen, die einen Medikamentenmissbrauch nahelegten. Museeuw hat jedoch bisher stets bestritten, gedopt zu haben.

Nachweisverfahren

EPO kann seit 2000 auch in geringen Konzentrationen durch ein mehrstufiges Verfahren, das durch Françoise Lasne und Jaques de Ceaurriz vom Laboratoire national de détection du dopage (LNDD) entwickelt wurde, im Urin nachgewiesen werden.

Glykosylierungen von Proteinen erfolgen speziesspezifisch, das heißt, das Glykosylierungsmuster von humanem EPO unterscheidet sich vom rekombinanten EPO anderer Spezies. Rekombinantes EPO wird gegenwärtig mit Hilfe transformierter Zelllinien unterschiedlicher Gattungen des Hamsters erzeugt (vgl. Abschnitt EPO als Therapeutikum). Beim rekombinanten EPO ist die Neuraminsäure zu etwa 95 % an Stickstoff acetyliert, etwa 2 % liegen als Glykolylacetyl-Derivat vor. Der Grad dieser unterschiedlichen Acetylierung sowie die An- und Abwesenheit sogenannter Repeats (immer wiederkehrende Zuckereinheiten) sind verantwortlich für unterschiedliche isoelektrische Punkte (pI) von humanem und rekombinantem EPO. Diese Eigenschaft wird analytisch bei der Isoelektrischen Fokussierung (IEF) zum EPO-Nachweis ausgenutzt.

Schritt 1: Mikro- und Ultrafiltration

Im ersten Schritt werden zunächst die im Urin enthaltenen Proteine durch Mikro- und Ultrafiltration von unlöslichen Partikeln befreit und konzentriert.

Schritt 2: Isoelektrische Fokussierung

Im zweiten Schritt erfolgt die Trennung zwischen humanem und rekombinantem EPO sowie der anderen enthaltenen Proteine mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) in einem Polyacrylamid-Gel mit geeignetem pH-Gradienten.

Schritt 3: Immunoblotting

Datei:Epo-Blotting.jpg

Immunoblotting- und Chemoluminiszenzverfahren zum direkten Nachweis von EPO

Im dritten Schritt erfolgt der eigentliche Nachweis durch ein Immunoblotting, bei dem die im Elektrophoresefeld aufgetrennten EPO-Isoformen auf eine Membran überführt und nachfolgend mit einem EPO-spezifischen monoklonalen Antikörper (MAK) überschichtet werden (Primäres Blotting). Die bindenden MAK werden anschließend im sauren Milieu und durch Anlegen eines elektrischen Feldes dissoziiert und auf eine zweite Membran übertragen. So erhält man ein erneutes Abbild der einzelnen EPO-Banden. Allerdings befinden sich auf der zweiten Membran keine EPO-Moleküle, sondern die spezifischen monoklonalen Antikörper (Sekundäres Blotting). Die Antikörperbanden werden durch einen Anti-EPO-MAK spezifischen zweiten Antikörper sichtbar gemacht. Dieser Sekundärantikörper ist an bestimmte Enzyme (zum Beispiel Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase) gekoppelt, die eine Substratumsetzung katalysieren, welche sich mittels Chemiluminiszenzverfahren quantifizieren lässt (Chemoluminiszenz).

Zu einem akademischen Streit über die Validität des Verfahrens kam es in Zusammenhang mit dem Fall Rutger Beke. Der belgische Triathlet wurde 2005 nach einem positiven Dopingbefund zunächst für 18 Monate gesperrt. Mit Hilfe eines Gutachtens durch das molekularbiologische Forschungsinstitut der Universität Leuven konnte Beke jedoch ein Jahr später einen Freispruch erwirken. Die Entwickler des Nachweisverfahrens wiederum bemängeln nachhaltig die im Gutachten aufgeführten Methoden und Rückschlüsse, die zur Entlastung Bekes geführt hatten.

Neben diesem direkten Nachweis geben Verlaufsprotokolle anderer Blutparameter Aufschluss über möglichen EPO-Missbrauch. Zu diesen Parametern zählen der Hämatokritwert und die Konzentration einzelner Blutzelltypen (Retikulozyten und Makrophagen), die Hämoglobin- und Eisentransferrin-Rezeptorkonzentration sowie die Gesamtserumkonzentration von EPO. Das EPO-Derivat CERA (siehe oben) lässt sich selektiv mittels eines ELISA-Tests nachweisen.

Vor völlig neuen Herausforderungen stehen Dopinglabors beim Nachweis der Variante Epoetin δ, da es sich um eine „humanisierte“ Form eines rekombinanten EPO-Moleküls handelt, die sich molekularbiologisch und biochemisch nicht vom nativen EPO-Molekül unterscheidet.

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Biosynthese und biologische Funktion

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• Glaspy J., Beguin Y. (2005), Anaemia management strategies: optimising treatment using epoetin beta (NeoRecormon). Oncology 69 Suppl. 2: 8-16. PMID 16244505
• Littlewood T. (2005), Epoetin alfa (Eprex) and quality of life. Curr Med Res Opin. 21 Suppl 2: S1-S2. PMID 15969857

EPO-Präparate der nächsten Generation

• Wrighton F.C. et al. (1996), Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin. Science 273: 458-464. PMID 8662529
• Battaglia A. et al. (2000), The fusion protein MEN 11303 (granolocyte-macrophage colony stimulating factor/erythropoietin) acts as a potent inducer of erythropoiesis. Exp Hematol 28: 490-498. PMID 10812238
• Hudson J.Q., Sameri R.M. (2002), Darbepoetin alfa, a new therapy for the management of anemia of chronic kidney disease. Pharmacotherapy 22: 141S-149S. PMID 12222584
• Kochendoerfer G.G. et al. (2003), Design and chemical synthesis of homogeneous polymer-modified erythropoiesis protein. Science 299: 884-887. PMID 12574628
• Bitonti A.J. et al. (2004), Delivery of an Erythropoietin-Fc Fusion Protein by Inhalation in Humans through an Immunoglobulin Transport Pathway. J Aerosol Med 18: 294-303. PMID 16181004
• Macdougall I.C. (2005), CERA (Continuous Erythropoietin Receptor Activator): a new erythropoiesis-stimulating agent for the treatment of anemia. Curr Hematol Rep 4: 436-440. PMID 16232379
• Chen S.Y. et al. (2005), Synthetic erythropoietic proteins: tuning biological performance by site-specific polymer attachment. Chem Biol 12: 371-383. PMID 15797221
• Hamilton S.R. et al. (2006), Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins. Science 313: 1441-1443. PMID 16960007
• Österborg A.C. et al. (2006), A novel erythropoiesis-stimulating agent (AMG114) with 131-hour half-life effectively treats chemotherapy-induced anemia when administered as 200 mcg every 3 weeks. J Clin Oncol 24, No. 18S: 8626. PMID 16982323
• Fan Q. et al. (2006), Preclinical evaluation of Hematide, a novel erythropoiesis stimulating agent, for the treatment of anemia. Exp Hematol 34: 1303-1311. PMID 16982323
• Coleman T.R. et al. (2006), Cytoprotective doses of erythropoietin or carbamylated erythropoietin have markedly different procoagulant and vasoactive activities. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 5965-5970. PMID 16585502

Nachahmerpräparate (Biosimilars)

• Louët S. (2003), Lessons from Eprex for biogeneric firms. Nature Biotechnology 21 (9): 956-957. PMID 12949539
• Schellekens H. (2004): Biosimilar epoetins: how similar are they? EJHP Practice 3: 243-247. PMID 16006274
• Boven K. et al. (2005), The increased incidence of pure red cell aplasia with an Eprex formulation in uncoated rubber stopper syringes. Kidney International 67: 2346-2353. PMID 15882278
• Niazi S.K. (2005), Handbook of Biogeneric Therapeutic Proteins. 1. Auflage, CRC Press.[4]
• Zylka-Menhorn V., Tippmann M.E. (2006), Biopharmazeutika sind „unnachahmlich“, Deutsches Ärzteblatt Jg. 103, Heft 6: A311-A314.[5]

EPO-Doping

• Scott J., Phillips GC (2005), Erythropoietin in sports: a new look at an old problem. Curr Sports Med Rep 4: 224-226. PMID 16004833
• Diamanti-Kandarakis E. et al. (2005), Erythropoietin abuse and erythropoietin gene doping: detection strategies in the genomic era. Sports Medicine 35: 831-840. PMID 16180943
• Sharpe K. et al. (2006), A third generation approach to detect erythropoietin abuse in athletes. Haematologica 91: 356-363. PMID 16503554

Nachweisverfahren

• Lasne F., de Ceaurriz J. (2000), Recombinant erythropoietin in urine. Nature 405: 635. PMID 10864311
• Lasne F. (2003), Double-blotting: a solution to the problem of nonspecific binding of secondary antibodies in immunoblotting procedures. J Immunol Methods 276: 223-226. PMID 12738375
• Beullens M. et al. (2006), False-positive detection of recombinant human erythropoietin in urine following strenuous physical exercise. Blood 107: 4711-4713. PMID 16493001
• Lasne F. (2006), No doubt about the validity of the urine test for detection of recombinant human erythropoietin. Blood 108:1778-1779. PMID 16926299

Weblinks

• Epogen
• Aranesp
• NeoRecormon
• Eprex
• Procrit
• Epomax
• DynEpo
• CERA
• EPO-Doping im Radsport

Quellen

Dieser Artikel behandelt ein Gesundheitsthema. Er dient nicht der Selbstdiagnose und ersetzt nicht eine Diagnose durch einen Arzt. Bitte hierzu den Hinweis zu Gesundheitsthemen beachten!